Астрономия и микроскопия

Это уже готовая к применению монтирующая среда.

Срезы обезвоживают в этиловом спирте разной концентрации или в изопропиловом спирте, меняя его несколько раз, а затем замещают спирт ксилолом, если используют монтирующую среду типа канадского бальзама или малинол. Если вы будете готовить препараты с канадским бальзамом, то всё равно будете капать вредный ксилол и это всё "перед носом". Лучше весной-летом на проветриваемом балконе.
Если используется монтирующая среда эупараль, то сразу после обезвоживания в изопропиловом спирте, срез помещают в эупараль и накрывают покровным стеклом. Максимум, что не понравится - это запах изопропанола. Но если вы содержали кошек, то запах изопропанола не страшен Эту монтирующую среду не купить в России, хотя я могу спокойно заказывать любые красители и монтирующие среды за рубежом.

НИКАКОЙ подсушки среза на воздухе, даже кратковременной, иначе возможны разрывы клеточных оболочек, артефакты и др. И тонкий срез может свернуться в трубочку...

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

Вы просто хотите складировать разные красители или есть конкретные задачи? Для себя нужно решить, что Вы хотите окрасить или выявить в растительных клетках. Исследования клеточной оболочки? Реакции на пектины, реакции на целлюлозу, выявление кутикулы, выявление углеводов, липидов и т.д. и т.д.
Или изготовление постоянных препаратов с полихромной (комбинированной) окраской тканей? Если для комбинированной окраски, то для новичков в этом деле лучше использовать простейшие двуцветные окраски с применением контрастных по цвету водорастворимых красителей.
Примеры:
1. Сафранин и водный синий.
2. Сафранин и водный зелёный.
3. Гематоксилин и эозин.
4. Хризоидин и светлый зелёный

Но окраску надо проводить по известным методикам, знать в какой краситель в первую очередь опускать срезы, затем отмывание излишков красителя и помещение среза в другой краситель. И т.д.

Самая простая, на мой взгляд, комбинированная окраска - применение уже готового раствора красителей по Этцольду, в котором применяют следующие красители: основной фуксин, сафранин, водный синий.
Такой готовый краситель я разливал по мелким ёмкостям с дозатором или пипеткой и использовал на занятиях не только со студентами, но и школьники в моей исследовательской лаборатории запросто окрашивают срезы и готовят постоянные препараты.

Для более подготовленных студентов-выпускников и школьников, занимающихся у нас не один год исследованиями, мы предлагаем более красивую полихромную окраску, но и более сложную.
К сожалению, я ещё не закончил методическое пособие по комбинированной окраске тканей растений и приготовлению постоянных препаратов. Не хватает времени...

Вот здесь я как-то публиковал свой рабочий план по полихромной окраске растительных тканей, почитайте:
http://cactuslove.ru/phorum/read.php?16,181100

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

Спасибо!
Прежде всего ядерные и цитоплазматические красители, так же хочу попробовать комбинированную окраску.

Хотите просто окрасить ядра клеток, чтобы их было видно или окраска для рассмотрения хромосом?

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

Да хромосомы хотелось бы увидеть

Краситель кармин есть у меня. Но чтобы рассмотреть хромосомы... приготовление таких препаратов не для новичков...Сложная методика приготовления красителей... К примеру, чтобы приготовить ацетокармин, надо нагревать раствор кармина в уксусной кислоте около часа. Нагревание идёт в колбе с обратным холодильником. Представляете, что это такое? Затем раствор охлаждают, фильтруют и т.д., добавляют хлорное железо.
Вам лучше сходить к генетикам в ВУЗ и попросить готовый ацетокармин или пропионовый кармин, этот краситель сохраняет свои свойства годами.

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

Актис, Ваши фотоработы великолепны!
Правильно ли я понимаю, что Astrablau - это анилиновый голубой (в форме водорастворимой соли),
а Acridinrot - это акридиновый оранжевый? Какова роль каждого красителя в окраске препарата?
Возможны ли замены, напрмимер, акридиновый оранжевый заменить эозином, чем-то еще - акрифлавин?
Уж больно хочется хотя бы приблизиться к той красоте, что Вы умеете делать!

Как то у генетиков смотрел мазок из крови с окрашенными хромосомами - не скажу, что очень впечатлило. Видно было плоховато. Увеличение всё-таки было большое и картинка была размытая. Как они окрашивали не имею понятия. Знаю только - фиксатор метанол. Кажется фиш-анализ смотрели.

_________________
Биолам Р11 с АПО и УФ объективами с СТ11, КФ-1 и КФ-4, Гамма 3D, АУ-26, Laboval 4 с Phv ахроматами, Peraval interphako, MB30 с ДИК и ФК KFZ (частично KFA и KFS), Биомед с набором ПЛАН ФК, Jenamed 2 с ФК

Метанол - стандартный фиксатор для мазков крови.

Есть предложение: вопросы, связанные с подгтовкой препаратов вынести в отдельную ветку форума. Все-таки топикстартер номинировал эту ветку как занимательные опыты для повторения с детьми.
Вот, открыл тему: viewtopic.php?f=6&t=1581

Спасибо.
Astrablau - это астраблау или его ещё называют в России "астра-синий". Этот краситель относят к группе фталоцианинов. Ещё его называют Basic Blue 140.
При комбинированной окраске астраблау можно заменить более распространённым красителем - алциановый синий.
Астраблау и алциановый синий - это кислотные красители, хорошо окрашивают неодревесневшие (живые) оболочки клеток в синие оттенки.

Acridinrot - это акридиновый красный, наиболее редкий и пока экзотический в нашей стране краситель. Его можно купить только за рубежом. Это основной краситель, относится к группе пиронина, окрашивает одревесневшие оболочки клеток в красные оттенки.
Плюс этот краситель является флюохромом.
Сининимы этого красителя: 3,6-Dimethyl-diamino-xanthylium-chlorid, Akridinrot BB, Rouge d'acridine

Акрифлавин - это также как и акридиновый красный, является флюохромом, его добавляют в эту комбинацию для контраста, в итоге наиболее одревесневшие оболочки остаются красными, а менее одревесневшие - красно-жёлтые, оранжеватые и т.д.

Флюохромы - это значит, что эти красители при воздействии на них лучей синего света, фиолетового и УФ способны излучать собственный свет определённой волны.

Заменить эти красители - это значит, что будет другая методика, другая комбинированная окраска.
По опыту хочу сказать, что окраска с помощью трёх А (акридиновый красный, акрифлавин, астра синий) даёт наиболее красивую картинку.

Конечно, можно применять другие комбинации более распространённых красителей, например: алциановый синий, основной фуксин, сафранин. И т.д.

Я могу опубликовать одну свою статью по полихромной окраске, которая была напечатана в сентябре 2012 года в сборнике научных докладов международной научной конференции. Мы в 2011 году модифицировали метод Уокера, поэтому окраска с помощью "трёх А" стала проще.

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

Смотрели хромосомы в ядрах клеток крови? В нейтрофилах?
Хромосомы мелкие даже в крупных ядрах некоторых растительных клеток, поэтому там особо ничего интересного для любителей, имеющих учебные или студенческие микроскопы.

_________________
Мой блог: http://microcosmos555.blogspot.ru/

Какой средний размер имеют хромосомы ? с апо 1.3 можно рассмотреть при условии правильной окраски?

Я лишь знаю, что подготовка препарата была сложной (кариотипирование) и хромосомы были в виде отдельных скоплений. Наблюдали в обычном проходящем свете лампы. Разные хромосомы мне показались очень похожими и имели лишь небольшие различия. Специалист, конечно, сразу находит разницу.

_________________
Биолам Р11 с АПО и УФ объективами с СТ11, КФ-1 и КФ-4, Гамма 3D, АУ-26, Laboval 4 с Phv ахроматами, Peraval interphako, MB30 с ДИК и ФК KFZ (частично KFA и KFS), Биомед с набором ПЛАН ФК, Jenamed 2 с ФК

Микрометод культивирования лимфоцитов цельной крови для хромосомного анализа по Аракаки.
Принцип метода.
В культуре периферической крови с фитогемагглютинином (ФГА — очищенный митоген бобов) лимфоциты вступают в митотический цикл ежесуточно.
Через 72 ч достигается максимальное число митозов.
Добавленный в культуру колхицин останавливает митозы на стадии метафазы, наиболее пригодной для анализа. Затем производят обработку клеток гипотоническим раствором для набухания хромосом, фиксацию и приготовление препаратов на стеклах.

Оборудование и реактивы.
1. Питательная среда Игла (среда № 199).
2. Фитогемагглютинин (ФГА),
3. Колхицин (порошкообразный).
4. Гипотонический раствор -0,075М раствор хлорида калия или 0,44% раствор трехзамещенного цитрата натрия.
5. Ацетат спирта 3 объема абсолютного спирта этилового или метилового, 1 объем ледяной уксусной кислоты.
6. Цельная сыворотка крупного рогатого скота.
7. Гепарин (патентованный раствор).
8. Краски азур и эозин.
9. Настольный бокс с бактерицидной лампой (ящик из стекла или плексигласа с отверстиями для рук, закрытыми резиновыми перчатками).
10. Холодильник.
11.Термостат на +37С
12. Центрифуга на 1000 оборотов.
13. Шприцы на 10,0 и 1,0 мл; иглы к ним.
14. Микропипетки.
15. Пастеровские пипетки.
16. Пипетки, градуированные на 1,0—10,0 и 20,0 мл.
17. Пробирки стерильные 10Х70 мм с резиновыми пробками (от пенициллиновых флаконов), закрепленными лейкопластырем.
18. Центрифужные пробирки.
19. Флаконы пенициллиновые с собственными пробками.
20. Резиновые баллоны для пипеток или тонкая резиновая трубка со стеклянным наконечником (для выдувания жидкости ртом).
21. Пробки резиновые (размер 10-12).
22. Предметные стекла.
23. Лейкопластырь.

Приготовление препаратов.
1. После тщательной очистки кожи пациента 70% спиртом из локтевой вены набирают 10 мл крови в стерильный шприц.
2. Кровь вводят в стерильную пробирку (заранее приготовленную в боксе и хранившуюся в холодильнике), содержащую 0,5 мг разведенного в 20 раз гепарина, через пробку, в которую дополнительно введена игла для прохождения воздуха.
Приготовленная таким образом кровь может храниться в холодильнике до 3 дней.
3. В настольном боксе включают на 15 мин бактерицидную лампу. Культивирование проводят в боксе.
4. В стерильный пенициллиновый флакон стерильной пипеткой вводят 0,5 мл перемешанной гепаринизированной цельной крови.
5. Во флакон с ФГА вводят 5 мл стерильной бидистиллированной воды или 0,85% раствора NаС1 и хранят в морозильном отделении холодильника.
6.Стерильной микропипеткой вводят во флакон с кровью 0,015 мл ФГА. Стерильной пипеткой (на 10мл) вводят 5-6 мл среды Игла (среда№199) и такой же пипеткой вводят 1 мл сыворотки АВ(IV).
7. Флакон герметически закрывают стерильной пробкой № 10—12, энергично встряхивают и ставят в термостат при 37° на 72 ч, ежесуточно встряхивая в одно и то же время.
8. Через 72 ч в нестерильных условиях во флакон с культурой вводят 0,1мл раствора Колхицина (1 мг на 100 мл 0,85% раствора NаСI).
9. Через час содержимое флакона переносят в центрифужные пробирки, добавляют 5 мл нагретого до 37° 0,555% раствора хлорида калия на 5-8 мин при комнатной температуре.
10. Центрифугируют 8 мин при 1000 об/мин.
11. Удаляют над осадочную жидкость, на осадок медленно наслаивают 3-4 мл ацетата спирта.
12. Через 30 мин содержимое пробирки перемешивают, центрифугируют 8 мин при 1000 об/мин, удаляют часть надосадочной жидкости.
13. Если надосадочная жидкость бурая, фиксацию повторяют.
14. На предметные стекла, обезжиренные промыванием в хромпике и хранящиеся в холодильнике в 10 % водном растворе этилового спирта, накапывают с высоты 30 см суспензию клеток.
15. Предметные стекла проводят над пламенем спиртовой горелки (чтобы поджечь фиксатор).
16. Препараты окрашивают по Нохту или Романовскому и микроскопируют с иммерсионным объективом.
17. Со считывают число хромосом не менее чем в 50 метафазных пластинках, лучшие из них фотографируют.

_________________
мой сайт http://labx.narod.ru/
Polyvar, Zeiss Imager Z1, Jenaval, Микротом Reichert Jung Biocut 2030, К.М.Н. 14.03.02

Микрометод культивирования лимфоцитов цельной крови для хромосомного анализа по Аракаки. кровь беспородной мыши.
получается что-то в этом роде.



http://fotki.yandex.ru/users/labx/view/518360/


http://fotki.yandex.ru/users/labx/view/518363/


http://fotki.yandex.ru/users/labx/view/518367/

_________________
мой сайт http://labx.narod.ru/
Polyvar, Zeiss Imager Z1, Jenaval, Микротом Reichert Jung Biocut 2030, К.М.Н. 14.03.02